當(dāng)細(xì)胞生物學(xué)家第一次發(fā)現(xiàn)可能有一種脂質(zhì)參與他們最喜歡的途徑時，這有點像在馬路對面找到一堵墻(就像當(dāng)脂質(zhì)學(xué)家在他們的路上找到一種蛋白質(zhì)一樣……)。

      由于脂質(zhì)的不同性質(zhì)，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)家都害怕在他們的研究過程中不得不面對這種情況。好消息是，有一些簡單的方法可以幫助克服這一障礙，使研究特定途徑中的脂質(zhì)變得更容易。在這里，我想介紹一些脂配體相互作用研究的分析和準(zhǔn)備工具。

1 覆蓋試驗Overlay assays-鑒定與給定蛋白質(zhì)相互作用的脂質(zhì)

      這些分析方法允許鑒定一種或多種脂質(zhì)與給定蛋白質(zhì)相互作用。

      與Western-blot原理類似，它們的原理是在表面涂上各種類型的脂質(zhì)，這些脂質(zhì)將與已知的蛋白質(zhì)接觸，這種蛋白質(zhì)將被標(biāo)記或抗體臨時檢測到。脂質(zhì)的載體通常是硝化纖維素膜(圖1)。與點印跡法一樣，需要優(yōu)化一些實驗參數(shù)(如緩沖液、蛋白質(zhì)純化或蛋白質(zhì)濃度)。

      當(dāng)可用蛋白質(zhì)的數(shù)量有，小的“覆蓋分析格式"可以用少于0.5 mg的蛋白質(zhì)進行檢測。這是一種簡單的方法來測試一種感興趣的蛋白質(zhì)對各種脂質(zhì)的結(jié)合能力!

2 下拉試驗Pull-down assays-發(fā)現(xiàn)一種已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伙伴

      對于相反的實驗設(shè)置，當(dāng)您想要識別已知脂質(zhì)的蛋白質(zhì)伴侶時，瓊脂糖為基礎(chǔ)的下拉試驗等制備技術(shù)將是您的選擇:

*瓊脂糖珠包被確定的脂質(zhì)可以被進一步孵育與細(xì)胞裂解液，上清液，重組蛋白…

* 然后相互作用的復(fù)合體通過離心將它們拉下來。

       它允許分離脂質(zhì)結(jié)合蛋白的數(shù)量適合進一步鑒定和表征。它經(jīng)常與細(xì)胞裂解液一起用于“撈出"脂質(zhì)對偶物(圖4)。

3 漂浮試驗Floatation assays-用于更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用

       當(dāng)你在尋找更高特異性的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用時，另一種基于脂質(zhì)富集脂質(zhì)體(用作脂質(zhì)/配體相互作用的基質(zhì)支持)的制備方法是可用的。

       與GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超離心)類似，脂質(zhì)體預(yù)結(jié)合到脂質(zhì)配體上，將沿著超離心制備的葡萄糖梯度分成幾個部分分布(圖5)。

這些富脂脂質(zhì)體有許多優(yōu)點:

*聚脂質(zhì)體PolyPIPosomes是聚合的脂質(zhì)體，

*增加穩(wěn)定性(長達(dá)6個月)，

*生物素標(biāo)簽，方便鏈霉親和素檢測，

*尺寸均勻(~200 nm)，可進行浮選試驗，

*這些脂質(zhì)體也可用于:表面等離子體共振，脂質(zhì)體覆蓋分析，ITC。

        想知道更多，讓你的生活更輕松，以防你偶然發(fā)現(xiàn)“可怕的脂質(zhì)"嗎?

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默瑞生物

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